Как работать с набором Elisa

Сэндвич-метод с двойными антителами

1. Покрытие: разбавьте антитело до содержания белка 1-10 мкг/мл с помощью 0.05MPH 9. Оксикарбонатный буфер для покрытия. Добавьте 0,1 мл в реакционную лунку каждого полистиролового планшета на ночь при 4°С. На следующий день раствор в лунках удаляли и трижды промывали промывочным буфером по 3 мин. (называемый промывкой, то же самое ниже).

2. Добавьте образец: добавьте 0.1 мл определенного разбавленного образца для тестирования в вышеуказанную реакционную лунку с покрытием и инкубируйте при 37 градусах в течение 1 часа. Затем вымойте. (Одновременно сделайте пустые лунки, лунки отрицательного контроля и лунки положительного контроля).

3. Добавьте антитело, меченное ферментом: добавьте 0,1 мл свежеразбавленного антитела, меченного ферментом (разбавление после титрования) в каждую реакционную лунку. Инкубируйте при 37 градусах от 0,5 до 1 часа и промойте.

4. Добавьте раствор субстрата для проявления окраски: добавьте 0,1 мл временно приготовленного раствора субстрата ТМБ в каждую реакционную лунку и инкубируйте при 37°С в течение 10–30 минут.

5. Прекращение реакции: добавьте 0,05 мл 2М серной кислоты в каждую реакционную лунку.

6. Оценка результатов: результаты можно наблюдать непосредственно невооруженным глазом на белом фоне: чем темнее цвет в лунке реакции, тем сильнее положительная степень, а отрицательная реакция бесцветна или крайне поверхностна. Обозначает знак «-». Значение ОП также можно измерить: на детекторе ELISA при длине волны 450 нм (410 нм, если для проявления окраски используется ABTS) измерьте значение ОП каждой лунки после обнуления лункой контрольного бланка, если оно превышает значение ОП более чем в 2,1 раза. указанного отрицательного контроля, который является положительным.

Косвенный метод

1. Разбавьте известный антиген до 1-10 мкг/мл буфером для покрытия, добавьте 0,1 мл в каждую лунку и оставьте на ночь при 4 градусах;

2. Умыться 3 раза на следующий день;

3. Добавьте 0,1 мл определенного разбавленного образца для тестирования (неизвестное антитело) в вышеупомянутые реакционные лунки, инкубируйте при 37 градусах в течение 1 часа и промойте;

4. (Одновременно сделайте пустой, отрицательный и положительный контроли лунок) Добавьте 0,1 мл свежеразбавленного меченого ферментом вторичного антитела (анти-антитела) в реакционную лунку;

5. Инкубировать при 37° в течение 35-60 минут, промыть;

6.' Окончательная промывка DDW.

Остальные шаги аналогичны шагам 4, 5 и 6 «Метода сэндвича с двойным антителом».